А. Куков², Е. Станкова¹, А. Сяров², А. Гончаров², И. Алтънкова¹, Й. Узунова¹
¹УМБАЛ „Лозенец”, Медицински факултет, СУ „Св. Климент Охридски”
²УМБАЛ „Лозенец”
Чревният микробиом е комплекс от многобройни и разнообразни микроорганизми (бактерии, вируси, гъбички, архаи и паразити – чревна микробиота), генетичният им материал и техните метаболити, обитаващи чревния тракт на човешкия организъм и създали взаимоотношения на симбиоза със своя гостоприемник. Той регулира храносмилането, метаболизма на ксенобиотици, поддържа структурната цялост на чревната лигавица, регулира имунитета и осъществява защитна функция срещу патогенни микроорганизми [1]. Установено е, че чревният микробиом оказва влияние и върху отдалечени органи, какъвто е белият дроб, чрез активиране на имунни клетки в гастроинтестиналния тракт. Чревните микроорганизми, техни метаболити или фрагменти от бактерии също така могат да се придвижат до белите дробове чрез лимфната циркулация и там да задействат имунните отговори на гостоприемника [2].
Чревната микробиота (ЧМ) на здрави индивиди се състои от около 100 трилиона микроорганизми, принадлежащи на видове и подвидове от над 17 бактериални фили [1]. Видовото разнообразие е от решаващо значение при оценката на безбройните форми на живот в биосферата в рамките на конкретна екологична общност. Този показател отчита три ключови екологични принципа: богатство на видове, изобилие на видове и равномерност на видовете. Богатството на видовете се отнася до броя на различните видове, присъстващи в определен регион, докато изобилието на видове загатва за броя на индивидите на всеки вид в рамките на една и съща област. Равномерността на видовете представлява разпределението или еднаквостта на видовете, живеещи в определената зона. От решаващо значение е, че видовото разнообразие служи като важна екологична концепция при оценката на „здравето“ на една екосистема, каквато е ЧМ. Това е така, защото балансираното съществуване на видово разнообразие и количество може да поддържа равновесието на екосистемата. Обикновено една по-разнообразна екосистема демонстрира по-висока продуктивност и по-голям капацитет да издържа на натиска на околната среда.
Както се вижда, ЧМ е една сложна екосистема, чието разбиране и тълкуване изисква задълбочен биоинформатичен анализ, който да даде възможности за стандартизирано сравнение и интерпретация на основни параметри на ЧМ на индивидуално и групово равнища. По този начин могат да се очертаят определени характеристики при здрави лица и при различни заболявания, които да се съпоставят помежду си.
Целта на настоящата статия е да представим една от важните характеристики, а именно разнообразието на ЧМ, определено чрез биоинформатичен анализ на величините „алфа и бета разнообразие“. Практическото приложение на тези показатели е изследвано при групи здрави деца и деца с бронхиална астма.
Алфа-разнообразие
Алфа-разнообразието се отнася до анализа на видовото разнообразие в дадена проба и се измерва чрез индекси: Chao индекс, АСЕ индекс, индекс на Шанън (Shannon), индекс на Симпсън (Simpson) и Good-coverage индекс. Видовото разнообразие е правопропорционално на първите три стойности, докато индексът на Симпсън корелира негативно с видовото разнообразие. По-високата стойност на Good-coverage индекса показва по-малко неоткрити видове в дадени проби. Индексът на разнообразието на Шанън е популярен показател, използван в екологията. Базира се на формулата на Клод Шанън за ентропията и оценява видовото разнообразие. Индексът взема предвид броя на видовете, живеещи в дадено местообитание (богатство), и тяхното относително изобилие (равномерност). Индексът на разнообразието на Симпсън е мярка за разнообразие, която взема предвид броя на наличните видове, както и относителното изобилие на всеки вид. С нарастването на видовото богатство и равномерността се увеличава и разнообразието. Като се има предвид едно и също видово богатство, по-голямото равномерно разпределение на видовете показва по-голямо видово разнообразие.
Всички гореизброени индекси за анализ на алфа-разнообразието се прилагат за характеризиране на сложни екосистеми, каквато е и чревният микробиом. Ние ги използвахме, за да сравним характеристиките на чревната микробиота в отделните групи: здрави деца, деца с алергична астма (АА) и деца с неалергична астма (НАА).
Бета-разнообразие
Бета-разнообразието се използва за оценка на разликите в комплексността от видове в дадените проби, т.е. до колко двете проби не си приличат по отношение на видовото разнообразие. Различни индекси като Bray-Curtis, количествен UniFrac и качествен UniFrac се използват за измерване на бета-разнообразието. Индексът на Bray-Curtis, един от най-често използваните индекси за отразяване на разликите между две съобщества, изследва изобилието от микроби, които се споделят между две проби и броя на микробите, открити във всяка проба. UniFrac разглежда филогенетичните връзки между микробите, открити в две проби. Той отчита разстоянието на еволюция между видовете – колкото по-голям е индексът, толкова по-големи са разликите между пробите. Количественият UniFrac взима предвид и изобилието от последователности, докато при качествения UniFrac това не се отчита.
Клинично проучване: определяне на алфа- и бета-разнообразието на чревния микробиом при здрави деца и деца с бронхиална астма и сравнение помежду им.
Бяха включени 66 деца, разделени в три групи – контролна група здрави деца (31), деца с АА (18) и деца с НАА (17).
Изследването на чревния микробиом бе извършено чрез NGS секвениране на микробна ДНК от фекалните проби на проучените деца. Получените сурови данни се обединяват в тагове и допълнително се клъстерират към оперативни таксономични единици (OTUs). OTUs се използват в изследванията за секвениране на ДНК на микробни общности, за да се очертаят разликите на видово ниво между организмите и представляват най-често използваната единица за измерване на микробното разнообразие.
Алфа-разнообразие на бактериалните видове в чревния микробиом на изследваните деца
На фиг. 1 са представени резултатите от получените OTUs (брой видове бактерии), както и индексите за алфа-разнообразие – Shannon, Simpson и Chao, за всеки индивид в сравнителен аспект между изследваните групи. Макар че не се наблюдава статистически значима разлика в откритите OTUs, установихме, че количеството на таксономичните единици е малко по-голямо в контролните проби (446.33 ± 94.45) в сравнение с двете пациентски групи – деца с АА и деца с НАА (414 ± 75.38 и 417.63 ± 78.37).
Както се вижда от фиг. 1, Shannon индексът е най-голям в контролните проби (в сравнение с пациентските групи), което означава, че бактериалното видово разнообразие в чревния микробиом е по-голямо при здравите деца в сравнение с децата с астма. Chao индексът, който отразява видовото богатство, също е по-голям при здравите деца в сравнение с децата с БА. Индексът на Simpson е в обратна корелация с количеството на бактериалните видове и е най-малък при групата на здравите деца в сравнение с пациентските групи.
Фигура 1. Сравнение на алфа-разнообразието чрез наблюдаваните OTUs и индексите на Shannon, Chao и Simpson. Контрола – зелен запълнен кръг; деца с АА – червен триъгълник; деца с НАА – сив обърнат триъгълник. GraphPad Prism.
Бета-разнообразие на бактериалните видове в чревния микробиом на изследваните деца
На фиг. 2 представяме визуализацията на бета-разнообразието, изчислено чрез индекса Bray-Curtis. На фигурата контролната група деца са представени с червени запълнени кръгчета, а децата с астма са със сини; тяхното разпределение корелира с формата на големите елипси (фиг. 2, панел А, В и С). Те онагледяват разликите между групите здрави и деца с астма.
На панел D сравнението е между деца с АА и деца с НАА. При този подход се установи, че няма статистически значими вариации в бактериалните видове при изследваните групи деца. От фиг. 2, панел А, се вижда, че бактериалните съобщества в пробите на здравите деца и всички деца с БА се припокриват и не се установяват значими разлики (p=0.62). Подобна картина се наблюдава и при сравнение между контролите и децата с АА (p=0.46). При анализа на бета-разнообразието между контролите и децата с НАА се вижда как повечето проби на контролите и децата с НАА се припокриват, но все пак наблюдаваме и проби на деца с НАА, които се открояват. Може да се каже, че между двете групи се установява тенденция за увеличаване на различията в микробните съобщества, като вътрегруповите различия в бактериалните общества на децата с НАА са по-малки в сравнение с контролите, но няма статистически значима разлика (p=0.21). Най-голямо различие на бета-разнообразието в микробните съобщества наблюдавахме при децата с АА и групата НАА, но статистическа значима разлика не бе достигната (p=0.09).
Фигура 2. PCoA диаграма на бета-разнообразието въз основа на индекса на Bray-Curtis между: К – контролна група; БА – всички деца с БА; АА – деца с алергична астма; НАА – деца с неалергична астма.
Заключение
Проведеният от нас анализ на алфа- и бета-разнообразието на чревния микробиом при деца с АА или НАА и здрави деца не установява статистически значими разлики, но показва, че бактериалното видово разнообразие и равномерност в чревния микробиом са по-голeми при здравите деца в сравнение с децата с БА. Това откриваме и в литературните източници – здравият чревен микробиом се характеризира с голямо таксономично разнообразие, голямо богатство на микробни гени и стабилна основна микробиота, докато промените при пациенти с БА включват главно намаляване на чревното микробно разнообразие и намаляване на относителното изобилие на полезните микроорганизми.
Библиография:
- Lloyd-Price J., G. Abu-Ali, and C. Huttenhower. The healthy human microbiome. Genome Medicine, vol. 8, no. 1, p. 51, 2016.
- Zheng P. et al.; Gut Microbiome and Metabolomics Profiles of Allergic and Non-Allergic Childhood Asthma; Journal of Asthma and Allergy 2022; 15:419-435
Статията е във връзка с научен проект с договор N80-10-26/08.04.2024 на СУ „Св. Климент Охридски“. Изказваме специални благодарности на BGI, China, за ползотворното сътрудничество по NGS анализа на пробите.